Inokulační metody rostlin

Před zahájením inokulace rostlin by měly být připraveny. Měly by být prosté infekcí, samozřejmě zdravé. Z tohoto důvodu se experimentální rostliny nejlépe pěstují ze zdravých semen ve skleníku nebo v pěstitelském domě v květináči (květináči) naplněné půdou prostou infekce. Semena před setím jsou dezinfikována konvenčními obvazy a půda je autoklávována pod tlakem 1 až 2 atm..

Když se pěstované rostliny zalévají bez smáčení povrchu listů a stonků (voda se nalije přímo do půdy nebo pomocí speciálně vložených zkumavek). Pokud je to možné, vyloučte cizí nebo náhodnou infekci přenášenou hmyzem nebo vzduchem.

Pokud nelze experimentální rostliny ve skleníkovém experimentu získat ze semen, pak se rostliny rostoucí v divokém stavu odeberou a přesadí do květináčů, po kterých se udržují ve skleníku po dobu alespoň jedné (nejlépe 1,5-2,0) inkubační doby nemoci způsobené zkoumanou houbou. Prakticky na to stačí 7-10 dní.

Při inokulaci rostlin houbami na poli je nutné předem izolovat určené nadzemní orgány od okolního prostředí zasklenými dřevěnými rámy, papírovými čepičkami, plastovými sáčky, netopýrovými nebo lampovými brýlemi - ty jsou přivázány ke sázkám a horní a dolní díry jsou uzavřeny vatovými tampony . Taková předběžná izolace po dobu 1 až 2 inkubačních období je nezbytná k ověření skutečně zdravého stavu experimentálních rostlinných orgánů. Kromě toho se ve všech případech snaží zajistit, aby se izolované rostliny nebo jejich orgány normálně vyvíjely, nebyly etiolovány, chlorotické, ochablé atd..

Je možné provádět experimenty na řezaných částech rostlin namočených ve vodě, v živném roztoku, jakož i na oddělených listech umístěných v roztoku benzimidazolu..

Metody inokulace rostlin jsou velmi rozmanité a závisí na biologii houby a roli infekce v patogenezi choroby, jakož i na cílech studie (kontrola patogenity kmenů, hodnocení rezistence odrůd atd.). Zvažte řadu očkovacích technik, které jsou poměrně dobře testovány a lze je doporučit v praktické práci..

Očkování rostlin může být provedeno jak patogenem pěstovaným na umělém živném médiu, tak přirozenou populací plísňových spór. V závislosti na úkolu se používají různá inokula - mycelium, spory sebrané z jedné odrůdy hostitelské rostliny nebo představující geografickou populaci atd..

Při volbě metody očkování se bere v úvahu produktivita práce, protože se často hodnotí tisíce odrůd. Metody a načasování umělé infekce co nejblíže přirozené. Ve všech případech jsou vytvářeny podmínky, které jsou optimální pro růst patogenu (teplota, vlhkost). Počet inokulovaných rostlin by měl být alespoň 10 s povinnou kontrolou.

Průnik infekce prostřednictvím květin a vaječníků je charakterizován řadou nemocí (zaprášená pšenice a ječmen, prasklina žita, helmintosporióza ječmene a ovsa, žlutá rez pšenice atd.). V tomto případě se inokulace provádí aplikací suchých spór nebo suspenzí plísňových spór na květiny a vaječníky. Například M.K. Khokhryakov (1969) naznačuje, že nejjednodušší metodou naočkování pšenice a ječmene prachovým smutem je postřik chlamydospor původců nemoci během kvetení obilovin z gázových vaků nebo řezání zasažených uší.

V.I. Krivchenko (1963) modifikoval vakuovou metodu inokulace pšenice smutným patogenem pomocí speciálního zařízení sestávajícího z válce, do kterého jsou umístěny uši zbývající na vinici. Tento válec má dvě výstupní trubice, z nichž jedna je připojena k čerpadlům a druhá slouží k přivádění vzduchu. Zezdola přes speciální vakuovou upínací zátku a hadici se dodává suspenze spór (0,2 g spor na 0,5 l vody). Podstata metody spočívá v tom, že jak čerpá z válce uši vzduchu, voda se spory tam vstoupí. Po přivádění vzduchu proudí suspenze zpět do nádoby. K získání spolehlivých údajů stačí nakazit 6–10 uší jedné odrůdy a při hodnocení rodin a linií hybridů alespoň tři uši.

E. E. Geshele (1964) rozděluje metody očkování smutu do dvou skupin: individuální infekce květin a celého ucha. V prvním případě se jedna horní a dvě spodní klásky oříznou nůžkami a prostřední květy se odstraní ze zbytku pinzetou. Poté se každá květina otevře a spory se zavedou pinzetou. Tato metoda má řadu úprav. Zejména můžete infikovat květ speciální pipetou s hruškou. Ve druhém případě je materiál obsahující infekční začátek smutu aplikován na zdravé ucho poté, co byly předtím provedeny řezy na úrovni zubu hrotu.

Ječmenné květiny jsou naočkovány konidiemi původce pruhované helmintosporiázy pomocí vakuového zařízení v období, kdy bodec ještě neopustil trubici, pouze špičkami markýz.

Květy ovocných plodin jsou infikovány houbami rodu Monilinia, a to aplikací suchých konidií s navlhčeným koncem jehly na stigma tloučku. Poté se květiny postříkají vodou ze stříkací láhve a na ně se položí izolační gáza namočená ve vodě, která se na jeden den pokryje plastovou fólií. V jižních oblastech jsou navíc naočkované květenství nejasné - dělají to samé, když jsou infikovány ušima.

Očkované ovocné větve jsou izolovány stejným způsobem jako květiny. Pokud se provádějí experimenty na řezaných výhoncích, pak se výhonky po aplikaci infekce na listy umístí do vlhkých komor vyrobených ze skleněných uzávěrů lemovaných vlhkým filtračním papírem zevnitř po dobu 24 hodin při optimální teplotě..

Při aplikaci infekčních agens na listy, stonky a jiné orgány rostlin se zpravidla používá suspenze spór patogenů (konidie). Voskový povlak na povrchu listu způsobuje, že houby pronikají, takže je odstraněn před naočkováním necháním listu procházet mezi mokrými prsty. Materiál obsahující infekci se zpravidla nanáší na spodní stranu archu ve formě kapky vodné suspenze ze spreje nebo inokula protřepává skalpelem. Někdy se používají suché spory, které se nanášejí na navlhčené listy sterilním štětcem..

Pro umělou infekci listů přímo na rostlinách lze použít malé objemové vlhké komory ve formě celofánových kelímků (průměr 20 mm), které jsou lisovány podél okrajů elastickou pružinou (metoda M. S. Dunina)..

Naočkované rostliny na určitou dobu (12, 24, 48 hodin) se umístí do vlhké komory, aby se zajistila úplnější infekce. V terénu je toho dosaženo aplikací suspenze spór v oblačných dnech nebo večer, zejména pokud se očekává rosa.

Infekční materiál obilné rzi se obvykle připravuje dvě hodiny před aplikací na rostliny. K tomu vezměte 200-300 zasažených listů, ponořte je do vody (0,5 - 1 l) a z nich opláchněte uredospory. Asi 150 litrů suspenze se utratí na 150-200 m2 výsevu (L.F. Rusakov, 1926). Za stacionárních podmínek se inokulum připravuje předem ve skleníku nebo na speciálních plodinách. Pro infekci pozemků - distributorů rzi by mělo být odebráno 5 mg uredospory na 1 m2, které se postřikuje společně s mastkem v poměru 1:30 nebo 1: 100. Při kontinuálním očkování na 1 m2 se spotřebují 2 mg životaschopných uredospor v případě následného potahování rostlin filmem a 20 mg bez mokré komory (K. M. Stepanov, 1966).

Umělá infekce rostlin rzí basidiospores (například lineární nebo hnědá) se provádí ve vlhké komoře. Části rostlin s rozvinutými teletosporami jsou odebírány a umístěny nad naočkovanou rostlinu tak, aby při dozrávání padaly basidiospory na její povrch.

Existují zprávy o možnosti inokulace patogenů pyrikulózy a plísní na jednotlivé listy obilovin umístěných ve vlhkých komorách a malé kroužky živých listů (průměr 12-14 mm) tabáku hubou Peronospora tabacinale. Současně se umístí do Petriho misek, jejichž dno je lemováno třemi vrstvami filtračního papíru nasyceného bez přebytku živným roztokem následujícího složení (v gramech na 100 ml vody): vinan draselný a sodný (KOSO - CHON - CHON - COONa) - 0,5- K2NRO4 - 0,1 - KNO3 - 2,0 - Co (N03) 2 - 0,06 - KCl - 0,03 - Mn04 - 0,001 a Mg04 - 0,5 (Isard, 1960).

Například při studiu povinných parazitů dřevin se používají speciální metody. Při práci s vokumetickými houbami, které způsobují deformaci ovoce a větví, se do nádob s vodou umísťují výhonky se známkami poškození vyřezanými z nemocných stromů, aby se uzavřely askospory, které jsou pokryty širokým skleněným víčkem. Pod okrajem kapoty jsou umístěna těsnění o výšce asi 10 cm pro přístup k vzduchu. Po 1-2 dnech se na postižených orgánech objeví marsupiální sporulace houby. Vytvořené askospory se přenesou sterilním skalpelem na experimentální zdravé rostliny, do vaječníků nebo pruhů, které se začínají vyvíjet. Zároveň jsou násilně odhaleny šupiny. Používají se i další speciální techniky založené na biologii patogenů, cílech experimentu a možnosti proniknutí infekce za určitých podmínek (Geshele, 1971)..

Při práci s původcem hrachové ascochitózy se podle metodiky Státní komise pro testování odrůd získává inokulum ve zkumavkách na šikmém agaru. Z jedné zkumavky houbové kultury se suspenze připraví protřepáním v 1 litru vody. Navíc by v jedné kapce kapaliny mělo být v průměru obsaženo 40–50 konidií patogenu. Na 1 m2 výsevu se spotřebuje 2 l suspenze.

Semena mohou být naočkována suchá nebo mokrá. Kontaminace semen se provádí při studiu tvrdé pšenice. Současně se spotřebuje 1 kg semen na 1 kg spór, v závislosti na očekávaných povětrnostních podmínkách během výsevu a v nadcházejících dnech. Pokud počasí není příznivé pro rozlití rány, zvyšuje se infekční zátěž. Optimální podmínky se považují za teplotu půdy v hloubce semene 6 Pokud mají být testovány malé šarže semen, jsou opyleny nadměrným množstvím spór a prošity sítem. Aby se vytvořilo potřebné infekční zatížení, měla by být semena ječmene a ovsa odstraněna z filmů a E. E. Geshele (1964) doporučuje odstranit pouze tu část filmu, která kryje embryo. V jiných případech se semena rozptýlí tenkou vrstvou na hustém povrchu, postříká se suspenzí spór a udržuje se ve vlhké komoře. Semena ječmene a ovsa jsou také úspěšně naočkována smutem ponořením do suspenze spór. Pro 100 g semen se připraví 100 cm3 suspenze ze 4 až 10 g spór. Semena se udržují v suspenzi po dobu 15 minut, směs se důkladně třepe. Potom se semena umístí do gázových sáčků, nechají se odtéct vodou a inkubují se po dobu 24 hodin při 20 ° C. Po vysušení se semena setí.

Ovesná semena, která jsou znečištěna žínky, s odstraněnými filmy se naklíčí v krabicích při 25 půdní vlhkosti a teplotě 20 ° C. Po vzniku jsou transplantovány do pole. Stejná metoda E. E. Geshele (1964) doporučuje použití v případě umělé infekce ječmene smutem a patogenem pruhované helminthosporiózy.

Při inokulaci ovocných stromů (shtambov) na kůře po 1-1,5 cm se použijí dva příčné řezy, mezi nimiž je kůra řezána ve středu v podélném směru, ohýbá křídla, vytváří několik mělkých řezů dřeva a zavádí se kultura sledovaného patogenu spolu s kouskem agarového média. Potom se kortikální chlopně uzavřou a místo infekce se pokryje plastovým obalem nebo pergamenem, přičemž se okraje zajistí pomocí provázku nebo lepicí pásky. Při použití papíru se pod obvaz umístí navlhčený kousek bavlněné vlny..

V případě infekce kosterních větví patogeny, které se mohou vyvinout pouze v dříve oslabených tkáních, jsou tyto tkáně cauterizovány poblíž místa inokulace..

V případě umělé infekce dřevin volitelnými parazity (houby rodu Cytospora a další.) experimenty se nejlépe provádějí v laboratorních podmínkách na řezaných výhoncích. K tomu se ze zkušební odrůdy vyříznou lignifikované výhonky dlouhé 150 mm a silné asi 10 mm v množství 20 ks. (10 kusů pro zkušenost a kontrolu). Poté se ve vzdálenosti 50 mm od horní části výhonku provede řez až do hloubky 5 mm - po povrchové sterilizaci se do něj vloží agarové médium s mykotickým mykáním. Místo očkování je utaženo plastovým obalem, který je na okrajích upevněn závity nebo izolační páskou. Na zadní stranu výhonku je bavlna umístěna pod film, který je v případě potřeby periodicky navlhčen injekční stříkačkou přes film.

Řízky se ukládají do sklenic s vodou nebo předem kalcinovaným mokrým pískem. Být ve vodě nebo písku, řízky začínají postrádat minerály půdy, jejich životní funkce oslabují a umírají. Tento proces trvá dlouho, což vám umožní určit načasování choroby odřezků s různým stupněm oslabení, tedy patogenní schopnost houby a rezistence rostlin.

Infikované výhonky se porovnávají s kontrolou pomocí pořadového kritéria X, obvykle v době smrti 2/3 odřezků nejcitlivější odrůdy. V případě, že zesílená tvorba kalusu bude procházet podél okrajů rány, rána se vyčistí a provede se sekundární inokulace bez přerušení experimentu..

Sazenice stromů mohou být inokulovány zavedením infekce do stonku pomocí lékařské stříkačky. Infekční začátek v kořenech můžete provést přímo v půdě a poškodit je kovovou tyčí (do výsledné rány se vnesou spory patogenů).

Očkování plodů a kořenových plodin se provádí aplikací suspenze spór patogenů na jejich sterilní povrch. V tomto případě můžete také použít suché spory, piercing nebo vroubkování kůže plodu, nebo injikovat vodnou suspenzi spór (1 kapka) injekční stříkačkou pod kůži. Někdy je infekce zavedena do hlubokého řezu kořenové plodiny a poté vložená řezaná část na své původní místo.

Inokulum se nejčastěji aplikuje na půdu, aby vytvořilo infekční pozadí bez poškození kořenových systémů - houba se nejprve rozmnoží na speciálních médiích.

Po mnoho let práce se širokou škálou druhů rostlin a odrůd se používají různá infekční prostředí. Mohou být přirozené a umělé a také se mohou lišit stupněm projevu nemoci (slabý, silný).

Při vytváření infekčního pozadí v půdě, například, původců vadnutí bavlny, se nejprve pěstují čisté houby v bankách se sterilními ovesnými semínky (100 zrn na 100 cm3 vody). Poté se kultury rozmnožují v lahvích s médiem stejného složení. Na každých 100 m2 plochy se aplikuje 3 až 4 kg kultury (další metoda je popsána níže).

Zavádění houbových kultur do půdy se také používá při práci s patogeny vadnutí (vadnutí) lilku a pepře - sklerotie patogenů se používají při pučení rostlin s předběžným poškozením kořenů.

Provádí se inokulace sazenic ječmene a pšenice původci helminthosporiózy, fusária, opiobolezu a dalších patogenů, přičemž se do semenných řádků a semen zavede kultura hub. Používají se čisté kultury hub pěstovaných na zrnech nebo agarovém médiu (0,5 škrobu, 0,02 KH2P04, 0,02 Ca (N03) 2 0,02 peptonu a 2 agarový agar). Používá se také infikovaná sekce slámy. Řádky během setí jsou pokryty infikovanou slámou v poměru 20 drcených rostlin smíchaných s 1 kg humusu na 25 m výsevní řady (E. E. Geshele, 1964).

Při vytváření infekčního pozadí patogenů sněhové plísně, směs kmenů (Fusarium nivale, Typhula incarnata atd.), které jsou předem pěstovány na okyseleném bramborovém agaru a poté rozmnožovány na sterilním ovesu. Před zavedením kultury hub do půdy se smíchají se zemí ve stejném množství a rovnoměrně se rozdělí po povrchu pozemku. Infekce se zavádí do půdy na podzim rychlostí 200 g kultury na oves na 1 m2. Kontaminovaná půda je shora pokryta vrstvou zeminy 1-1,5 cm. První rok na infekčním pozadí se provádí průzkumný výsev. Pokud je současně exkrece rostliny z patogenů stejná, je příští rok pozemek použit pro experimenty (V.K. Neofitova, N.A. Novik, 1969).

Lněná lněná rez infekční pozadí (Melampsora lini) vytvářejte pomocí lynčích slám, které jsou ovlivněny původcem choroby (směs odrůd). Taková sláma (stonky) je položena na podzim pod sněhem. Na jaře jsou postižené stonky drženy ve vodě po dobu 2-3 hodin a je kontrolováno klíčení teletospor, které klíčí na 50 až 100 segmentech stonků ve vlhké komoře. Klíčící spory se počítají 48 hodin po umístění do vlhké komory.

První metoda je použitelná při studiu patogenní biologie a inokulace jednotlivých rostlin, druhá - v terénním hodnocení odrůd.

Při vytváření infekčního (provokativního) pozadí pro původce verticilinové vilt bavlny na pozemku v prvním roce se voní rostlinné zbytky napadené houbou (guza-pai) a hojně se zalévají. Následující rok se provede vyrovnávací výsev bavlníkového kultivaru, který je náchylný k této nemoci, po sklizni jsou zasaženy zasažené zbytky rostlin. Rovnovážný výsev je také nezbytný pro ověření spolehlivosti provokativního pozadí. Teprve po takovém ověření může být považováno za připravené pro testování odrůd.

Lněná infekce antracenózou (Colletotrichum lini) provedené zaváděním infekce do půdy a postřikem sazenic suspenzí spór. Jako infekční materiál se používají zasažené lněné slámy a sazenice, stejně jako kultura čistého patogenu pěstovaná na ovesném a mladinovém agaru. Pro nakažení půdy se do ornice zavádí čistá plísňová kultura, nemocné sazenice a lněná sláma. Vegetativní rostliny se naočkují suspenzí spór ve fázi sazenic (T. V. Krylova, Yu. T. Karpunina, 1969)..

Při nakažení bílou hnilobou slunečnice (Sclerotinia liBertiana) použít metodu, při které se do semen pomocí ručního sázecího stroje zavedou do každého hnízda současně se semeny 2 až 3 malé sklerózy původce onemocnění patogenu. Uvedená metoda umožňuje získat příznaky nemoci na bazální části stonku (A. I. Lukaševič, 1969).

Zvýšení zásob plísní slunečnice (Plasmopara helianthi) se provádějí následovně. Nejprve se připraví zoosporová suspenze, na kterou se zasažené listy a vrstva vlhkého filtračního papíru umístí do mokrých komor. Mokré komory se udržují při teplotě 16 až 20 ° C. Zralé konidia se odstraní z povrchu listů žiletkou nebo mokrým tamponem a připraví se suspenze. Očkování rostlin se provádí udržováním suspenze lepivých semen v suspenzi po dobu 5 až 8 hodin při teplotě 17 až 19 ° C. Slunečnicové sazenice se poté vysadí do krabic o rozměrech 50 × 40 × 15 cm, skleníků nebo na otevřeném terénu. V krabicích a pařeništích se rostliny umísťují podle schématu: mezi řádky 10–15, v řadě 2-3 cm - na otevřeném terénu - mezi řádky 45–60 a v řadě 3-5 cm.

Příčinný činitel jetele sklerotinie se pěstuje ze sklerotie na plátcích brambor ve vlhké komoře. Potom se plátky s vyvinutým parazitovým myceliem umístí pod rostliny u kořenového krku.

Podobným způsobem se dosáhne zvýšení počtu infekcí v půdě opakovaným zaváděním zbytků rostlin infikovaných patogeny plísní plísní slunečnice, kořenové a kořenové hniloby pšenice a ječmene, kýlu, zelí, hrachové ascochitózy atd..

Půdní patogeny (houby při porodu Verticillium, Fusarium atd.) plodiny ovoce a bobuloviny jsou předem rozmnožovány v čistých kulturách na živném médiu. Obvykle se obilná zrna používají jako živný substrát, který se vlévá do baňky vodou (přibližně v poměru 1: 1) a sterilizuje se v autoklávu při tlaku 1 atm. Poté se do baňky s obilím zavede infekce odpovídající houby a inkubuje se po dobu 10-15 dní s periodickým třepáním, aby se substrát promíchal. Současně se semena holých plodin (pšenice, žita, luštěniny) smísí s plevou nebo jemně nasekanou slámou, aby se zabránilo tvorbě svalnaté hmoty..

Aplikační dávky takové hubové kultury v půdě se liší v závislosti na typu patogenu a odrůdy rostlin. Jako podporu lze vzít na vědomí, že 3 kg kultury by se mělo aplikovat na 120 m2 bobulových plantáží nebo 1,5-2 kg na krmnou plochu jednoho stromu (v závislosti na systému výsadby)..

Výše uvedené způsoby inokulace rostlin jsou tedy velmi rozmanité, s některými změnami jsou použitelné pro práci s téměř všemi fytopatogenními houbami na široké škále zemědělských rostlin..