Diagnostické metody virových a viroidních chorob rostlin

Vizuální diagnostická metoda

Ve většině případů není obtížné určit virovou povahu choroby. Obvykle je to určeno vnějšími znaky, jako jsou lineární chlorotické vzory nebo prstencové vzory na mladých listech. Jejich identifikace je však často obtížná, protože viry mají asymptomatický (latentní) charakter vývoje. Symptomy závisí na stavu organismu, agresivitě patogenního kmene, podmínkách prostředí a době, po kterou virus nebo viroid zůstává v hostitelských buňkách. Například příznaky onemocnění jsou jasně vyjádřeny u rostlin rostoucích na jasném světle a při mírné teplotě, při vysoké teplotě a při špatném osvětlení, příznaky nemoci nemusí být vůbec vyjádřeny..

Vyčištění žil nejmladších listů je často jedním z prvních příznaků systémové virové infekce. Žíly se stanou žlutými a průsvitnými. Listy, které se tvoří později, mohou být mozaiky, skvrnité nebo úplně žluté (chlorotické)..

Inkubační doba onemocnění závisí na typu viru, hostitelské rostlině a podmínkách prostředí, ale v každém případě je to několik dní nebo týdnů.

Pokud jsou na sazenicích patrné první příznaky viózy, pak byl zdroj infekce buď v semenech, nebo k infekci došlo prostřednictvím nosiče. Pokud jsou infikované rostliny umístěny v kultuře zcela náhodou nebo pouze v řádcích vysazených ze stejné šarže, pak to znamená, že rostlinný materiál byl s největší pravděpodobností infikován. Pokud se v některých oblastech pole nacházejí nemocné rostliny a výskyt infikovaných oblastí je způsoben rozdíly v půdě, existuje důvod, proč předpokládat šíření virů v půdě.

Je třeba také poznamenat, že existují příznaky charakteristické pro virozu, ale způsobené jinými příčinami (léze způsobené fytoplasmy, některé bakterie a sající škůdci). Příznaky podobné virové infekci jsou často způsobeny poruchami minerální výživy, jako jsou poruchy spojené s nedostatkem železa (obr. 1) Regulátory růstu a herbicidy různé povahy mohou být způsobeny různými deformacemi orgánů (obr. 2).

Použitím metody vizuální diagnostiky, přesné identifikace vnějšími příznaky poškození viry a viroidy je nemožné, lze definitivní odpověď získat pouze pomocí instrumentálních metod (enzymatická imunoanalýza, PCR analýza atd.).

Metoda indikátorových rostlin

Metoda indikátorových rostlin - Jedná se o velmi běžnou metodu diagnostiky virových a viroidních chorob a identifikaci jejich patogenů. Metoda indikátorových rostlin je založena na použití indikátorových rostlin, které ve většině případů dávají jasné a specifické příznaky charakteristické pro určitý typ patogenu. Bylinné indikátorové rostliny jsou infikovány mechanickým očkováním šťávou, v důsledku čehož se infekce může projevit jako místní nekróza, změna barvy a inhibice růstu.

U viru rajčatové aspermie se jako indikátor používají mladé tabákové rostliny (Nicotiana glutinosa), pro diagnostiku X-viru brambor - sférický amarant (Gomphrena globosa) K detekci rajčatové infekce viroidem používají hlízy bramborových hlíz ve tvaru vřetena jako indikátory škapoli (Scopolia sinensis) nebo citlivé odrůdy rajčat. V některých případech mohou být jednotlivé izolované listy indikátorových rostlin použity k infekci. Viry tolerantní k šťávě jsou roubovány na indikátorové rostliny různými způsoby. Ve vzácných případech se pro přenos viru používají hmyzí nosiče a rostliny parazitů.

Sérologicky diagnostická metoda

Metoda je založena na srážkové reakci (tvorba sraženiny) mezi specifickými protilátkami a proteiny (antigeny) patogenu. Metoda sérologické diagnostiky není použitelná pro identifikaci viroidů z důvodu nepřítomnosti proteinové složky, jakož i pro řadu virů nesnášenlivých do šťávy se slabými imunogenními vlastnostmi. K identifikaci virů v rostlině lze použít následující modifikace sérologické diagnostiky:

1) Enzymaticky vázaný imunosorbentový test (ELISA) - nejcitlivější metoda, která vám umožní získat kvantitativní odhady. Je založen na specifickém rozpoznávání povrchových antigenů viru protilátkami v přítomnosti enzymů. Tato metoda je v praxi široce používána pro identifikaci plodinových virů, vhodných pro sériové analýzy.

2) Metoda kapání. Provádí se následujícím způsobem. Na sklíčku se kapka rostlinné šťávy smíchá s kapkou antiséra. Po několika minutách je reakce vyhodnocena pod mikroskopem při malém zvětšení v tmavém poli nebo dokonce vizuálně, bez mikroskopu.

3) Metoda dvojité difúze - provádí se v agarovém gelu, aby se určily sférické a jiné malé viry. To se provádí touto metodou v některých jamkách, které se rozřežou ve vrstvě agarového média, přidá se antisérum a v jiných - vyčištěná rostlinná šťáva. V gelu se virové částice a protilátky k sobě navzájem difundují, aby se setkaly, a v místě setkání vytvářejí odlišné precipitační linie v případě jejich komplementární specifity.

4) Radiální imunodifúzní metoda. Při použití této metody se antisérum přidá přímo do agarového média, zatímco jamky se naplní rostlinnou šťávou. Reakce je pozitivní, pokud se kolem jamek vytvoří sraženina ve tvaru kruhu..

5) Adsorpční metoda. Metoda je založena na skutečnosti, že před reakcí s antigenem se protilátky vážou na inertní částice na velké částice, například na latex. Při reakci s antigenem dochází k jasně viditelné aglutinaci celého komplexu..

Metoda elektronové mikroskopie

Na ultratenkých řezech nemocných rostlinných tkání pomocí elektronových mikroskopů můžete určit strukturu, tvar a dokonce i velikost virů nebo viroidů. Elektronový mikroskop se často používá v kombinaci se sérologickými metodami (imunoelektronická mikroskopie) a lze detekovat virové částice s vrstvenými protilátkami. Metoda elektronové mikroskopie se používá velmi zřídka kvůli vysokým nákladům na vybavení a činidla, obtížnosti izolace virů a viroidů, oxidaci rostlinných sekcí a řadě dalších faktorů.

Metoda elektroforézy

Tento způsob je založen na separaci dříve purifikovaných nukleových kyselin viru (viroid) nebo jeho proteinů v gelu pod vlivem elektrického proudu a následným zbarvením zón. Metoda elektroforézy umožňuje určit hmotnost a velikost virových nebo viroidních struktur. Metoda je široce používána pro vizuální zkoumání konečného produktu polymerázové řetězové reakce. Chcete-li zaznamenat výsledky, vyfotografujte gel v procházejícím nebo odraženém světle.

Molekulární biologické metody jsou založeny na znalosti struktury molekuly RNA (DNA) viru nebo viroidu. Nejběžnějším testem je amplifikace (množení) druhově specifických RNA sekvencí během polymerázové řetězové reakce (PCR). Jednotlivé fragmenty RNA izolované ze studovaných rostlin, které jsou specifické pouze pro jeden druh nebo rod virů, jsou multiplikovány enzymy v přítomnosti primerů (odpovídajících oligonukleotidů). Navíc jejich počet v konečném reakčním produktu milionkrát překračuje počáteční počet kopií vybraného fragmentu RNA. Dále je virová RNA (DNA) detekována gelovou elektroforézou nebo imunofluorescencí. Metoda je široce používána v praktických virologických studiích..

Metoda DNA sondy je také založena na principu komplementarity nukleových kyselin. Syntetizovány jsou specifické sondy, které hybridizují pouze se specifickými nukleotidovými sekvencemi viru nebo viroidní RNA. V závislosti na výběru sond je možné rozlišovat skupiny, typy a dokonce i kmeny virů a viroidů.

Metoda inkluze

V důsledku vývoje virů se v rostlinných buňkách tvoří shluky virových částic (inkluze) zvané Ivanovského krystaly, které jsou viditelné konvenčním světelným mikroskopem. Každý virus má svou vlastní formu virových inkluze, které se nejčastěji tvoří v buňkách epidermis listů nebo v buňkách vlasů. Například virus tabákové mozaiky má krystaly ve tvaru šestiúhelníku a jehly - virus brambor X obvykle tvoří sférická amorfní tělíska. Ke zjištění viru zelené skvrnité mozaiky okurek, listů brambor kroucení a některých dalších se používají chemické analytické diagnostické metody..