Kultivační média a konzervace kultur fytopatogenních patogenů

Pro čisté houby - fakultativní saprofyty a fakultativní paraziti, při zachování jejich životaschopnosti za účelem dalšího studia, se používají různá živná média. Tato média se rozlišují mezi pevnými a kapalnými se známým a neznámým chemickým složením, přírodní a uměle připravená. Výběr konkrétního typu živného substrátu závisí na potřebách fungálního organismu a na cílech studie. Například při studiu odolnosti rostlin, aby se vyhodnotila odolnost hostitelské rostliny vůči toxickým látkám patogenu a vliv jejího uvolňování na růst patogenních forem, je nutné získat hojnou sporulaci.

Specifická média jsou vybírána v průběhu experimentální práce. Houba se vysílá současně na různých médiích ve středu Petriho misek (trojmo) a udržuje se na teplotách optimálních pro svůj vývoj. Pozorování se provádějí po dobu 12 až 15 dnů nad růstem a vývojem houby (růstová energie, nástup a charakter sporulace, hustota mycelia atd.), V důsledku toho se vybere nejvhodnější médium. Při použití standardních syntetických médií lze jejich složení změnit přidáním a vyloučením různých chemických složek.

Často je třeba najít prostředí, ve kterém houba roste a vyvíjí se lépe než v přírodě. Toho lze dosáhnout díky skutečnosti, že po sterilizaci v prostředí jsou konkurenční mikroorganismy zničeny a její složky podléhají hlubokým biochemickým změnám, které přispívají k lepší absorpci některými houbami. Obvykle se jedná o agarová média s odvarem nebo infuzí (extrakty) z hostitelské rostliny nebo stonky jetele. Takže 100 g čerstvých nebo 50 g sušených orgánů, které živí houby, se odebírá do 1 litru vody. Hmota se rozdrtí, vaří se po dobu jedné hodiny, obnoví se původní objem kapaliny, zfiltruje se, poté se přidá 2-2,5 agar-agar, rozpustí se a sterilizuje (M.K. Khokhryakov, 1969).

Během kultivace hub parazitujících na dřevinách I.I. Miikevich použil přírodní živná média připravená podle tohoto receptu. Jemně nasekané větve některých druhů stromů (200 g) byly nality do vody (1 1) a udržovány po dobu 12 hodin při 80 ° C, poté byla infuze filtrována a byl přidán agar-agar (2,5). Poté bylo médium sterilizováno po dobu dvou hodin tekutou parou v Kochově aparátu. Ve zvláštních studiích byly připraveny extrakty z různých odrůd, které byly koncentrací (1 v sušině) vyrovnány postupným ředěním. Je možné použít podobné přírodní prostředí ve vyšší koncentraci.

Pro určité systematické skupiny patogenních hub vybrali mnozí vědci přírodní substráty živin a identifikovali média se známým chemickým složením. Tak bylo experimentálně prokázáno, že druh rodu Fusarium rostou dobře na vařených zrnech rýže - houby rodu Piricularia vyvinout hojnou sporulaci na agarovém médiu s odvarem zrn pšenice nebo kořenových plodin mrkve. Složení pevných živných médií pro jednotlivé druhy a skupiny hub jsou uvedeny v tabulce 20.

Při přípravě média je třeba mít na paměti následující okolnosti:

1. houby obvykle rostou lépe v prostředí bohatém na uhlohydráty, ale jejich růst na takových médiích může sporulaci na dlouhou dobu snížit-
2. většina hub dává přednost mírně kyselé reakci (pH 6,0 - 6,5), zatímco bakterie dávají přednost neutrální (pH 7,0) nebo mírně zásadité-
3. uhlohydráty a bílkoviny v kyselých a alkalických roztocích se při zahřívání ničí, takže by měly být mírně sterilizovány nebo přidávány samostatně-
4. agar se rozpustí v polovině normy vody po dobu 1 až 2 hodin a živiny ve zbývající vodě, po které se složky smísí-
5. agar neztvrdne ve velmi kyselém nebo zásaditém prostředí-
6. pepton lze vyloučit hlavně z medií pro houby-
7. uvařená voda by měla být upřednostňována destilovanou, protože první obsahuje užitečné stopové prvky pro houby rodu Phytophthora lépe používat destilovanou vodu-
8. pro média obsahující rostlinný materiál se předběžně kreslí při nízkých (bramborový agar) nebo vysokých (bramborový dextrózový agar).

V některých případech (při studiu toxických sekretů patogenů, enzymů atd.) Se používají kapalná živná média. Například toxické účinky sekrecí Deuterophoma tracheiphila bylo studováno na médiu připraveném trváním na mletých výhoncích hostitelské rostliny (200 g výhonků na 100 cm3 vody). Pro smutkové houby se doporučuje následující složení: 0,03 g K2S04 - 0,01 g NH4NO3 - 10,0 g dextrózy (nebo maltózy) - 0,01 g CaCl2 - 0,01 g Mga (P04) 2-4H20 a voda 100 cm3.

Pro různé studie o biologii houby a odolnosti rostlin vyvstává potřeba dlouhodobého skladování čistých plodin. Po skladování však řada patogenních hub mění morfologické a kulturní znaky a někdy ztrácí patogenní vlastnosti. Proto před provedením experimentů s houbami po dlouhodobém skladování v čisté kultuře je nutné obnovit jejich patogenitu provedením pasáží hostitelskou rostlinou.

Složení živných médií pro pěstování fytopatogenních hub

Široce rozšířeným způsobem, jak udržovat čisté houby, je jejich pravidelné nasazování na čerstvá živná média. Většina plodin se vysazuje 2-3krát ročně. Při opětovném výsadbě se přenášejí hlavně spory a v nesporových formách se mycelium z okrajové zóny kolonie.

Reseeding se provádí ve dvou opakováních a 3 kopie každé houby se ponechají ke skladování, spočítání a opětnému nasazení předchozího období. Jeden z nových výsevů se používá pouze pro budoucí výsevy, druhý - pro screening během experimentálních prací.

Pro dlouhodobé skladování hub je lepší použít škrobnatá a celulózová média bez cukru. Řada polosaprofytických hub je dobře chráněna na sterilním přírodním materiálu (například houby rodu Cytospora na větvích hostitelské rostliny) - v tomto případě je nejvhodnější teplota 4 až 5 ° C. Hluboké chlazení (přibližně - 20 ° С) uspokojivě zachovává životaschopnost hub po velmi dlouhou dobu.

Houbové kultury lze také konzervovat pod minerálním olejem, po lyofilizaci (lyofilizace za sníženého tlaku) a pod kapalným dusíkem v ampulích. Pokud houby vydrží úplné zpracování, budou životaschopné po dobu 10 a více let. Použití těchto metod však vyžaduje těžkopádné a drahé vybavení..

Za normálních podmínek se sbírka hub nejlépe uchovává v širokých zkumavkách v šikmém růstovém médiu uzavřeném bavlněnými vložkami. Pozor však na poškození plodin klíšťaty (druh práce) Tyroglyfus a Tarsonemus), zejména v jižních oblastech a v létě v mírném klimatu. Když se dostanou do zkumavky, baňky a Petriho misky, jedí plodiny, infikují je bakteriemi a kontaminují se.

Existuje mnoho způsobů, jak se s těmito roztoči vypořádat. Především je však třeba dodržovat obecnou hygienu, přijmout opatření k zajištění toho, aby hmyz nelétal do laboratoře, buďte opatrní při práci s organickým materiálem a s půdou. Veškerý nový materiál musí být po přijetí pečlivě zkontrolován. Pokud je to možné, měly by být zajištěny oddělené místnosti pro čistý a špinavý materiál..

Dostatečně husté bavlněné svíčky jsou obvykle nepropustné pro klíšťata a přívod vzduchu do kultury není narušen. Pro větší záruku mohou být korky ošetřeny jedy, které mají škodlivý účinek pouze na klíšťata. Doporučuje se také použití hedvábného papíru. K tomuto účelu po ucpání okraje zátky hoří v plameni hořáku a přikryjí ho lepkavou teplou želatinou síranem měďnatým (síran měďnatý - 20, želatina - 20, voda - 60). Tento povlak se potom fixuje přes konec zkumavky hedvábným papírem. Po vysušení se přebytečný papír spálí. Takový papír je velmi tenký s póry, které zabraňují pronikání roztočů a zajišťují přístup vzduchu. Stejným způsobem můžete ucpávat baňky, ale gumové zátky musí být odstraněny a hedvábný papír před použitím sterilizován..

Je také užitečné uzavřít všechny baňky, kelímky a zkumavky kontaminovaným materiálem po přijetí papíru.

Všechny kultury by měly být očíslovány a registrovány na zvláštních kartách, které zaznamenávají číslo a název kultury, kde a kde byla přidělena, datum alokace, způsob izolace, název média použitého k opětovnému výsevu, výsledky pozorování růstu patogenu v čisté kultuře a zaznamenány funkce.