Izolace fytopatogenních hub na čisté kultury

Jak zdůraznil N. A. Naumov (1937), soubor metod izolace a kultivace hub se liší v širokém rozmezí v závislosti na účelu studie. Koncept experimentů se však hodí do jednoho systému. Před získáním studované houby v čisté kultuře je nutné mít tkáň nebo mycelium nesoucí spór, bez infekce epifytickou mikroflórou, která někdy zkresluje obraz, což komplikuje identifikaci a izolaci postižených tkání.

Jednou z nejjednodušších metod získání mycelia nebo sporulačních orgánů (včetně řady povinných parazitů) je použití tzv. mokré komory. Obvykle se používá pro jejich výrobu. Petriho jídla nebo Kokha. Dno misek a vnitřní povrch víček jsou potaženy kruhy filtračního papíru odpovídajícího průměru, sterilizovány při teplotě 110 ° C po dobu dvou hodin a navlhčeny sterilní vodou. Malé části vyšetřovaných tkání v množství 3 až 10 vzorků po povrchové sterilizaci jsou položeny na dno šálků přímo na filtrační papír rovnoměrně po jeho povrchu.

Povrchová sterilizace částí nemocných tkání může být provedena pomocí plamene hořáku na alkohol (plamen), proudu vody nebo speciálních chemikálií. Metoda povrchové sterilizace přírodního substrátu je vhodná pro dřevo, kořeny, semena nebo plody. Čím objemnější je předmět, který je sterilizován, tím důkladněji a déle je možné jej zahřát, aniž by se obával životaschopnosti mycelia uvnitř tkání.

Někdy je nutné izolovat patogenní houbu z polorozloženého materiálu nebo z bahnitých částí rostliny (peritherapace strupovitosti na padlých listech atd.). V tomto případě se zkušební předmět umístí na jemné síto a promývá se několik hodin pod tekoucí vodou.

Následně je materiál odebraný k výzkumu dodatečně vyčištěn a dezinfikován z povrchu ponořením do jedné z následujících látek: 96- nebo 50. alkohol po dobu 2-3 minut - roztok chloridu rtuťnatého (0,1.) S expozicí od několika sekund do tří minut - 0,5-1,0 nd roztok manganistanu draselného (do 20 minut) - vyčištěný bělicí roztok (1.) - 0,1-1,0 nd roztok bromové vody (několik sekund) nebo do roztoků jiných dezinfekčních prostředků poté se promyje sterilní vodou. K tomuto účelu lze použít formalínový roztok 1: 300, následovaný ochlazením předmětu v nádobě parou od 30 minut do 2 hodin.

Studie hub, které se vyvíjejí ve vlhkých komorách, by se měly provádět přímo v kelímcích při malém zvětšení mikroskopu v procházejícím nebo odraženém světle..

Po výskytu sporulace nebo známkách vývoje mycelia se subkultivuje na živném médiu na agaru přímo do zkumavky pro šikmý agar nebo předtím na agarovém médiu rozlitém v Petriho miskách. Povinné parazity se pěstují na živých rostlinách nebo zvláštních prostředích.

Pro další práci je velmi důležité očistit kulturu. To se provádí pomocí elektrického zapojení, zředěním ve sterilní vodě nebo pomocí zkumavek.

1. Malé množství houby se vezme na kultivační smyčku a na Petriho misky se nanese na povrch agaru. Jak je mozková mrtvice prodloužena, spóry se stále více dělí, dokud v důsledku toho jednotlivé kolonie nevzniknou z několika nebo jednotlivých spór.

2. Inokula spór se umístí do zkumavky se sterilní vodou (10 ml), pak se určité množství suspenze (například 1 ml) přenese sterilní pipetou do zkumavky s 9 ml sterilní vody. Čerstvá sterilní pipeta se používá ke smíchání kapaliny a přenesení 1 ml do další zkumavky obsahující 9 ml sterilní vody. Šlechtění pokračuje podle potřeby. Takové desettisícové ředění má některé výhody oproti pomalému zapojení. Při konečném ředění se do roztaveného agaru přidá 1 ml suspenze spór, ochladí se na asi + 40 ° C..

3. Vezměte pět zkumavek odpovídajícího agarového média, roztavte je a ochlaďte na + 45 ° C. Poté se do jedné zkumavek zavede malé množství spór - zkumavka se posouvá mezi dlaněmi a obsah se nalije do Petriho misky. Prázdná zkumavka se znovu naplní z jiné zkumavky roztaveným médiem, posouvá se mezi rukama a nalije se do druhého šálku. Tento postup se opakuje s dalšími třemi zkumavkami..

Při provádění teoretického výzkumu nebo analýzy populace jakékoli geografické formy je nezbytné získat kulturu z jednoho sporu. Téměř monosporová kultura mnoha hub se získá následujícími způsoby.

1. Slabá suspenze spór se připraví na sterilním sklíčku ve sterilní vodě ponořením kalcinované zvlhčené smyčky do sporulační kultury. Tato suspenze spór se nanese podél linie v Petriho misce na velmi tenkou agarovou desku připravenou ve vroucí vodě a udržuje se při +24 ° C. Pokud se to provádí v 16-17 hodinách, pak v 9-10 hodin následujícího dne se obvykle pozoruje nástup klíčení a připravenost spór na izolaci..

Při práci s binokulárním (stereoskopickým mikroskopem) se Petriho miska pohybuje podél linie značky a vybírají se vhodné klíčky. Vhodná jehla vytvoří výřez hangáru asi 2 mm kolem spory. Tento čtverec a oblast bezprostředně kolem něj se kontrolují pod malým zvětšením biologického mikroskopu, aby se zajistilo, že existuje pouze jedna spóra.

Blok agarového vrabce se poté přenese pomocí sterilní jehly pod dalekohled v agarové plotně nebo zkumavce.

2. Živné médium se nalije v tenké vrstvě do sterilních Petriho misek, poté se odebere zkumavka se sterilní vodou a do ní se zavede malé množství spór testovacích hub a důkladně se protřepe ve vodě. Poté se kovovou smyčkou odebere 4-5 kapek suspenze spór a převede se na skleněné podložní sklíčko. Pod mikroskopem se spočítá počet spór v každé kapce. Pokud dojde k poklesu v průměru n spór, do zkumavky se přidá sterilní voda, aby se zvětšil její objem v n+1 krát.

Navíc můžeme předpokládat, že v jedné kapce bude průměr jednoho sporu. Poté se odeberou 3 až 4 kapky ze zkumavky se zředěnou suspenzí spór a přenesou se do Petriho misek na agarovém médiu. Kapky by měly být od sebe odděleny v relativně velké vzdálenosti. Pod mikroskopem zkontrolujte počet spór padajících do každé z těchto kapek. Prohlížení je ze spodní části šálku, který je za tímto účelem pečlivě obrácen. Současně jsou vybrány z kapiček, ve kterých je obsažena jedna spóra, a jsou označeny na skle voskovou tužkou. Kolonie získané v Petriho miskách se prosejí v šikmých agarových zkumavkách.

Někdy se kapka suspenze obsahující jednu sporu umístí na sterilní sklenici v Petriho misce a přidá se k ní kousek agarového média - poté, co na ní roste houba mycelium, se kultura přenese do zkumavky nebo Petriho misky.

3. Hansen (H. R. Hansen, 1926) použil tenké skleněné kapiláry, snížené suspenzí spór na teplé agarové médium. Tyto kapiláry byly poté mikroskopicky vyšetřeny a rozřezány na kousky, z nichž každá obsahovala jednu spóru. Tyto kusy byly poté podrobeny povrchové sterilizaci a umístěny do agarové destičky.

Můžete použít jiné metody získávání monosporových kultur, které jsou uvedeny v literatuře (například metoda „suché jehly“ Hannah a další). Takže, aby se získala kultura monospor z uredospor, shlukují se obilky na suchém sklíčku. Poté, s koncem natažené skleněné tyčinky, je jedna spora oddělena pod dalekohledem nebo malým zvětšením mikroskopu. Konec hole je předem otřen vatovou vatou zvlhčenou methylovaným lihem nebo alkoholem. Vybraná spóra se přenese kapkou vody na list rostlin. Takové manipulace se provádějí asi 200krát, s ohledem na to, že míra přežití je obvykle 6-10.

Při izolaci monopodulové kultury houby se provádí předběžné množení rezivosti, takže na listech se vytvoří jednotlivé uredopustuly. K tomu se naočkuje malé množství spór..

Po obdržení počátečních pustulek v důsledku monosporální nebo monopuskulární kultury houby v nich začnou v určitých odrůdách množit spory a opakují proces reprodukce rostlin dobře vyvinutými uretropody 2-3krát. V důsledku toho se hromadí dostatečné množství inokula pro následnou práci s ním.

Izolace čistých kultur z různých orgánů a tkání má své vlastní vlastnosti. Při povrchovém poškození plodů se vnější poškozená vrstva oškrábe a mycelium se vyklíčí ve vlhké komoře, načež se kolonie znovu naočkuje na agarové médium. Dříve postižený povrch se důkladně omyje sterilní vodou..

Při izolaci kultur z vnitřních částí plodu se důkladně promyjí, dezinfikují v rtuťovém chloridu (1: 100) po dobu 5 minut a poté se znovu promyjí sterilní vodou. Kousky ovoce odříznuté z vnitřních tkání sterilním skalpelem se umístí na živný agar.

Při izolaci patogenů, které způsobují vnější poškození kořenů, použijte techniku ​​popsanou pro ovoce. U vnitřních lézí jsou kořeny důkladně omyty, spáleny a pak jsou vytvořeny příčné nebo podélné řezy. Výsledné malé kousky vnitřní nemocné tkáně se naklíčí na agarovém kultivačním médiu..

Izolace hub z listů, okvětních lístků a dalších delikátních orgánů je spojena se známými obtížemi, protože v tomto případě musíme téměř úplně opustit povrchovou sterilizaci pomocí chemikálií, které mohou ovlivnit patogenní mycelium v ​​mesofilu. Chcete-li zvýšit přesnost a spolehlivost selekční práce, měli byste použít co nejmenší části tkání a zároveň zvýšit jejich celkový počet..

Houby, které infikují kůru a dřevo (tracheomykóza, hniloba, nekróza), lze izolovat přímo z postižené tkáně nanesením povrchově sterilizovaných kousků nebo plátků na kultivační médium nebo ze spór a mycelia získaných ve vlhké komoře. Dřevo a kůra by měly být čerstvé, protože plísně se vyvíjejí ve zastaralých vzorcích, které ucpávají plodinu..

Poškozené dřevo se dezinfikuje ponořením na několik minut do 95% alkoholu nebo 0,5% roztoku manganistanu draselného a následným plamenem. Poté se povrchové části vzorku oříznou sterilním skalpelem nebo mikrotomem a destičky od několika mikronů do tloušťky 5-10 mm se vyříznou zevnitř a přenesou se do živného média..

Při izolaci kultury z ovocných tělísek hymenomycet, se nejprve ořízne povrchová vrstva a malé kousky o průměru 4 až 5 mm se vyříznou z vnitřku nosiče ovoce a polovina se ponoří do živného agaru. Poté se vyvinuté mycelium převede do šikmého agaru.

Za účelem izolace endogenního mycelia z mladých sazenic nejsou postižené části sterilizovány, ale pouze umyté, aby nedošlo k jejich zabití - materiál je mírně tráven a umístěn na živný agar nebo ve vlhké komoře - vznikající mycelium je rychle separováno a snaží se zabránit růstu saprofytických mikroorganismů.

Starší sazenice se dezinfikují v 0,5% roztoku manganistanu draselného, ​​promyjí se vodou a umístí se do vlhké komory, odkud se vyvíjené mycelium převede do živného média. Je také možné použít části stonku, které jsou uspořádány na agaru, aby se vyklíčilo mycelium patogenních hub.

Mikroflóra nemocných semen se obvykle analyzuje po svém vývoji v kultuře na živném médiu (M. M. Samutsevich, 1931). Za tímto účelem se odebere celkový vzorek ze skupiny semen z různých míst, spočítá se 200 semen a 25 kusů se umístí do Petriho misek na agarové médium.

Při stanovení povrchové infekce se semena nesterilizují, aby se vytvořila hluboká infekce, jsou držena v manganistanu draselném (0,5) po dobu 2-3 minut nebo ponořena do čistého alkoholu po dobu 1 minuty.

V některých případech se dezinfikovaná semena rozřeže na dvě části sterilním skalpelem. Silně mumifikovaná semena se předběžně inkubují na filtračním papíru zvlhčeném sterilní vodou, po vysušení a plameni se umístí do Petriho misek. Jak se objevuje sporulace patogenu, jsou přeneseny do šikmého agaru.

Když je izolována čistá kultura, jsou houby předběžně pěstovány na mírně okyseleném agarovém médiu nebo želatině (N. A. Naumov, 1937). Během počáteční izolace patogenu nelze použít kapalná nebo vysoce navlhčená média, protože to přispívá k rozvoji saprofytických mikrobů. Patogenní houby byste také neměli zasévat na pevné živné médium: rýži, brambory, chléb a další produkty.

Pro identifikaci patogenů, které přetrvávají v půdě, se za účelem jejich následné izolace odebírají vzorky z charakteristických půdních rozdílů (podzol, chernozem, serozem atd.) V různých hloubkách z určitých plodin atd. Při odběru vzorků je půdní část sterilní nástroj oddělí požadovanou vrstvu, ze které se odebere vzorek o 10 až 20 g a umístí ji do sterilní misky nebo obálky. Doporučuje se odebírat půdu z horní polohy (do 3 cm) a hlouběji, na úrovni umístění hlavní hmoty kořenů. Pro úplnou charakterizaci místa je nutné získat informace o předchozích plodinách a kyselosti půdy (pH) za tři roky.

Při studiu šíření infekce v terénu se vykopávají zemní jámy každých 5 metrů v jednotné oblasti, pro průzkumné průzkumy postačuje 5 až 10 půdních jám na úsek.

Shromážděná půda se několik dní suší do sucha na vzduchu v papírových obálkách, rozdrtí se a nanese se na živné médium agaru pomocí sterilní špachtle, skalpelu a dalších nástrojů. Každý vzorek (10–20 g) je distribuován do 6–7 Petriho misek, poté jsou misky uchovávány v termostatu při teplotě 20–25 ° С a pravidelně sledovány. Jak se houbové kolonie vyvíjejí, jsou přeneseny do šikmého agaru ve zkumavkách. Přítomnost izolovaných hub je stanovena běžnými metodami. Po 7 až 8 dnech od počátku růstu kolonií se poháry stávají nevhodnými pro screening plísní kvůli znečištění životního prostředí saprofytickými mikroorganismy.

Studium půdních plísňových mikromycet je možné jejich izolací v čisté kultuře nebo metodou „zanášejících desek“, půdních mikrokamer, pedoskopů vyrobených z velmi tenkého skla a dalších technik.

Izolace mikroorganismů, včetně fytopatogenních hub, v životaschopném stavu od vody a vzduchu, je oblastí zvláštního výzkumu. Existují různé metody analýzy využívající vzorkovače, automatické objemové a setrvačné pasti (F. Gregory, 1964 - Yu. P. Bochkov, A.I. Voronova, V.F. Dumsky, 1966 - A.I. Klochko, 1969 atd.). .).